17. 형질전환입니츄-풀때기

'ㅅ' 그렇습니다. 

집에서 놀고 있는 라이츄입니다. 

요즘 네모네모 라미츄 보는 맛에 빠져 있습니다... 거울 보라고 거울 자기자신 그렇게 보지마 

자 일단 저번에는 박테리아... 그러니까 생존왕 미스터 박에 형질전환을 하는 법에 대해 배웠습니다. 

미스터 박의 세포벽에 구멍을 내거나 흐물흐물하게 만든 다음 거기에 외부 DNA를 집어넣고 잘 키워주시면 끝!!! 인데... 

그럼 풀때기는??? 애초에 식물은 세포'만' 따로 키우지 않습니다... 그리고 식물세포에는 세포벽이 있어서 이걸 뚫고 가기도 힘들어요. 

그럼 어떻게 할까요? ㅇㅅㅇ 

1. A.tumefaciens(최근 라이조비움 라디오박터로 업데이트됐다고 하네요) 

호랑이 담배 배우던 시절... 예나 지금이나 식물의 병충해는 인류의 과제 중 하나였죠. 못생겨져서 상품성이 떨어지는 건 둘쨰치고... 못생겼어도 먹을 수 있으면 먹으면 되잖아요? 애가 자라질 못해... 자라질 못 하니 뭐가 나오질 않네. 게다가 이 줄기 이거 매끈해야 될 줄기가!!! 

이게 뭐야!!!!!! 줄기가!!! 

뿌리가!!! 죄다 이래요!!! 이걸 어떻게 할거야... 

당시 과학자들은 이 병에 대해 조사한 끝에 원인이 되는 균을 찾았습니다. 

그게 이 놈입니다. Agrobacterium tumefaciens죠. 

그런데! 원래 병균=박멸의 대상이어야 맞는'데'... 

2. 본격 병균의 DNA 껴넣기 

과학자들은 이 놈을 연구하다 아주 골떄리는 특성 하나를 발견합니다. 

A.tumefaciens는 감염된 식물의 DNA 안에 자기 DNA를 끼워 넣는 성질을 가지고 있습니다. 그것을 T-DNA라고 하죠. transfer DNA라 그렇게 부르는겁니다. 우리도 줄임말 많이 써요 ㅇㅅㅇ 

이것이 Ti plasmid라는 겁니다. A.tumefaciens가 가지고 있는 플라스미드죠. 저 플라스미드를 보시면 left border와 right border가 있죠? 저 안에 있는 유전자를 식물에 끼워 넣는겁니다. 여튼 이런 특성을 가지고 있네?? 그럼 이 녀석에게 밥도 주고 지낼 곳도 주면서 좀 구슬리다가 유전자 조작한 거 넣어주고 그걸 식물에 감염시키면? 그 유전자는 균을 통해 식물에게 가는거죠. 

여기는 LB RB로 표시되어 있는데, 이 안쪽에 있는 유전자를 식물에게 낑겨 넣는겁니다. 

3. 애기장대의 형질전환

참고로 식물체에 따라 저 균을 이용 못 하는 경우도 있어요. (일단 애기장대나 쌍떡잎식물, 그리고 벼는 저거 쓰는 듯) 

일단 형질전환을 할 유전자를 먼저 지지고 볶아서 클로닝을 하고 그걸 아그로박테리아이 집어 넣어야 합니다. 그리고 중요한 건 뭐냐, 균의 양이 많아야 합니다. 물론 너무 많으면 안되고요... 3_3 그리고 형질전환 대상인 식물체가 필요한데 이것도 식물체가 너무 늙으면 안 됩니다. 가능하면 꽃이 많이 핀+꽃봉오리가 많은 걸로 해야 돼요. 

일단 형질전환을 시킬 때는 청년기(...)인 애기장대(심은 지 한달 지난 거...?)를 준비한 다음 이미 생긴 씨방을 다 잘라버립니다. 아냐 꽃봉오리 자르는거 아냐 꽃 핀 건 괜찮으니까 두세요 그냥... 그리고 형질전환체라는 표시를 합니다. 그리고 끈적끈적한 물질(균이 잘 달라붙으라고)을 약간 넣은 배지에 미리 적당한 농도로 키워 둔 균을 풀어서 잘 섞어줍니다. 아냐 그렇게 세게 하면 균 죽어요 이사람들아 걔 쿠크다스야... 여튼 배지와 잘 섞은 균을 꽃 위에 정성스럽게 한방울씩 떨어트리면 됩니다. 아니면 꽃을 배지에 담그고 한 10초정도 계셔도 돼요. 

그 다음 봉지로 밀봉해 준 뒤 하루정도 있다가 밀봉을 풀어주면 일단 형질전환은 된 겁니다. 이제 형질전환체를 선별해봅시다. 

4. 형질전환체의 선별

일단... 멘델의 유전 법칙은 다들 아시죠? 우성 열성 이거? ㅇㅅㅇ 

아그로박테리움을 이용한 돌연변이에는 크게 두 종류가 있는데, 우성인 돌연변이와 열성인 돌연변이가 있습니다. 전자는 말 그대로 형질전환 된 돌연변이의 형질이 우성인 거고 후자는 그 반대죠. 보통 후자의 경우 멀쩡하던 유전자가 T-DNA에게 영 좋지 않은 곳을 겨냥당해서... 

고... 고자가 되는......건 아니고 발현을 못 하게 됩니다... (근데 유전자 변이 잘못돼서 식물체가 고자가 되는 경우도 있긴 합니다... 쭉정이가 나온다던가...) 그리고 이런 돌연변이는 그냥 돈 주고 사시면 되고... 실험실에서 만드는 건 대부분 우성 유전이예요. 

자 일단 3에서 형질전환 한 개체를 T0(형질전환체라 T입니다. 돌연변이 유발 개체는 M)이라고 합니다. 형질전환을 마친 T0를 잘 길러서 무사히 종자를 받았으면 이게 T1입니다. 이걸 심는데 어디다가 심느냐... 박테리아에 넣어준 벡터에 따라 항생제나 제초제가 들어갑니다. 여기서는 지옥문 벡터, pHellsgate12이라는 벡터를 예로 들어보겠습니다. 지옥문 무엇 

일단 LB, RB 사이에 있으면서 ccd를 끼고 있는 쪽이 식물에 들어가는 쪽입니다. 그 ccd가 유전자 들어가는 자리인데, 저기에 유전자가 없어 빈 벡터일 경우(저 그림 고대로 넣을 경우입니다) 보통은 균이 자살합니다. 그 반대쪽이 균꺼인데 균이 이 벡터를 가지고 있으면 스트렙토마이신과 스펙티노마이신, 식물체에게 제대로 유전자를 낑겨넣었을 때 식물체는 카나마이신이라는 항생제에 저항성이 생깁니다. 즉 카나마이신+알파(균은 죽여야죠)이 들어간 항생제를 넣은 배지에 저 씨를 뿌릴 건데... 어떻게 하느냐면...... 

배지에 깜지 쓰듯이 하나하나 뿌리시면 됩니다. 손에 쥐가 날 거예요. 여튼 이렇게 T1을 파종했으면 여기서 또 선별을 해야 하는데... 선별은 간단합니다. 그냥 그 위에서 멀쩡하게 자라는 거 뽑아다가 영양 배지에서 며칠 더 키우다 심으시면 됩니다. 참 쉽져? ㅇㅅㅇ 이렇게 키운 T1의 종자를 받으면 그게 T2인데... 이걸 또 한포기 한포기씩 받을 거예요. 그러니까 T2-1, 2, 3, 4... 이렇게 되는 거고, 여기서부터 슬슬 선별이 시작됩니다. 

아까 우성 유전이라고 했는데, 그럼 어떻게 선별하나요? 그건 간단합니다. 

대충 이렇게 되는건데, tt(열성 순종)는 카나마이신 배지에서 다 죽습니다. 못살아요. 그리고 살아남는 건 순종 우성이랑 잡종(...)이 있는데, 잡종과 순종 우성을 가리기 위해서는 다음 대에 또 씨를 뿌려야 합니다...ㅠㅠ 참고로 T2에서 살아남는 식물:죽는 식물의 비율은 대략 3:1입니다. 이론상 3:1인데 세 보면 2.9:1도 있고 3.1:1도 있고 그래요. 얼추 3:1에 맞는 걸 다음 대에 선별하는거죠. 잡종이라면 다음 대에도 3:1이 나올 거고, 순종이라면 전부 다 카나마이신 배지에서 살아남고... 이런 식인거죠. ​​

다음 시간에는 C4, C3, CAM이란 무엇인가에 대해 얘기하겠습니다. ㅇㅅㅇ