라이츄 과학츄

|  일단 큰 틀은 생물학(그냥 본인 전공 관련해서), 과학을 벗어나지는 않습니다.

2017.11.06 12:04

4. 전기영동이었츄

조회 수 527 추천 수 0 댓글 18
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일하기 싫어서 사무실에서 놀고 앉아있습니다. 
출근하면 졸리고 막 그래요... 3_3 
 
자 자 아무튼 저번에는 PCR로 DNA를 콘트롤 씨 콘트롤 브이를 할 수 있다고 했는데... 이 피쌸이 잘 됐는지를 확인하려면 우리는 전기영동이라는 걸 해야 합니다. ㅇㅅㅇ 그래서! 오늘은 여기에 대해 설명하고자 합니다. 
분량이 길어져서 파트 하나로 빼버렸음 
 

 

1. 전기영동이란 뭔가요? 

어 별거 없고 전기를 한쪽 방향으로 흘려서 디엔에이를 크기 별로 정렬하는 거예요. 진짜 별 거 없습니다. 젤에 대해서는 조금 이따가 설명하기로 하고, 일단 원리에 대해 설명을 드릴게요. 

 

DNA 사슬은 그 구조가 5'에 인산기가 있고 3'에 염기가 있는 구조예요. 

 

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요건 ATP긴 한데 ATP가 아데노신 트리포스페이트거든요? 그러니까 저 왼쪽에 인산기가 세 개 있잖아요. DNA를 구성하는 염기는 위의 ATP에서 인산기(PO4-) 두 개가 빠진 형태예요. 이런게 A T C G가 있어요. 그리고 인산기, 그러니까 PO4-는 음전하를 띠고 있답니다. 다들 아시겠지만 전기는 같은 극성끼리는 어떻게 한다? 그렇죠, 밀어내는 겁니다. 
 
젤이 사각형인데, 그러면 젤 위쪽에 DNA를 놓고 위에서 음전하로 전기를 흘리면? (아래는 +) DNA도 음전하를 띠니까 음전하를 피해 멀리멀리 내려가겠죠. 그런데 이걸 어떻게 크기별로 나누나요? 그건 간단합니다. 자, 생각해 보세요. 몸집이 작은 아이랑 여러분이랑, 각각 동대문에서 인파를 헤치고 나아갈 때 걸리는 속도가 다르겠죠? 아이는 상대적으로 덩치가 작으니까 틈이 보이면 쏙쏙 지나갈 수 있어요. 하지만 어른들은 지나가려면 익스큐즈미 아임쏘리 스미마셍... 그런 겁니다. 크기가 작은 DNA는 같은 시간 동안 전기를 흘려 줘도 더 멀리 갈 수 있고, 크기가 큰 DNA는 그렇지 않죠. 
 
2. 전기영동을 하려면... -젤
전기영동을 하려면 일단 젤을 만들어야 합니다. 

 

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젤의 재질은 한천이예요. 우뭇가사리라고도 하는 그 말랑말랑한 거 맞아요. 물론 저 젤은 식용 아님 

 

그림에 보면 w/v %라고 되어 있는데 이게 무슨 얘기냐면... 우리가 백분율을 표시할 때는 v/v 혹은 w/v로 표시를 해요. 각각 부피 바이 부피, 무게 바이 부피인데 분모(슬래시 오른쪽)는 일단 다 부피죠? 이건 용액의 부피를 말해요. 그리고 위에 들어가는 건 용매의 부피 혹은 무게가 되는거예요. 예를 들어 볼게요. 10%의 글리세롤 용액을 10ml 만들었을 때, v/v%일 때는 부피 바이 부피이기때문에 글리세롤 1ml과 물 9ml이 들어가요. 하지만 w/v일 때는 물은 변함없이 9ml인 반면 글리세롤의 부피는 조금 달라져요. 글리세롤은 물보다 밀도가 높기 떄문에 무게를 따로 계산해 줘야 하거든요. (아마 980ul인가 그럴듯) 사실 v/w 나 w/w도 있긴 한데 물은 어차피 v=w라... 3_3 

 

자! 각설하고 다시 본론으로 돌아올게요. 한천 젤은 w/v로 만든다고 했는데, 그러면 이 젤은 어떻게 만드나요? 간단해요. 내가 전기영동 할 DNA의 크기에 따라 한천이 들어가는 양이 달라져요. 제가 위에서 작은 DNA는 같은 시간동안 전기를 걸어줬을 때 젤의 밑으로 밑으로 쭉쭉 간다고 했잖아요? 사실 이게 DNA 크기 뿐 아니라 한천의 농도도 영향을 주거든요. 자, 예를 들어 볼게요. 여러분이 사람이 별로 없는 길을 걸을 때는 그냥 갈 수 있어요. 하지만 동대문이나 명동 같이 사람이 많은 길을 걸을 때는? 사람들에게 부딪히기도 하고 사람들이 안 비켜주면 돌아서 가기도 하고 뭐 그렇죠? DNA도 마찬가지예요. 한쳔의 농도가 높아서 젤이 단단하면 큰 DNA는 전기를 백달 걸어줘도 얼마 못 가요. (이건 실화입니다) 

 

만약 내려야 하는 DNA는 3kb 막 이렇게 되는데 젤이 2%면 DNA가 암만 내려도 한천이 너무 쫀쫀해서 통과를 못 하고, 반대로 내려야 하는 DNA가 수십bp인데 젤이 1% 아래(가끔 이렇게 만들 떄도 있습니다)면 DNA가 젤을 통괘해서 내려가는 사태가...... (그러면 PCR이 돼도 잘 안 보이죠) 

 

참고로 보통은 1~2%로 많이 만들고 그 이상은 잘 안 만들어요. 

 

아, 위에 보이는 트레이, 캐스터, 콤은 젤을 만드는 틀의 구성품이예요. 먼저 트레이에 캐스터를 넣고, 콤을 꼽은 다음 한천을 붓고 굳히면 콤이 꼽혀 있었던 모양으로 구멍이 나면서 굳는 거고, 그 구멍으로 DNA를 로딩하는거죠. 그런데 트레이에 넣은 상태로 로딩하는 게 아니라 저 젤만 들어서 분리한 다음 전기영동 하는 기기에 넣어야 하는데 트레이랑 콤만 있으면? 젤 분리하기가 그지같겠죠... 그래서 트레이에 캐스터를 먼저 넣고 콤을 꼽는거예요. 저렇게 하면 콤을 빼고 캐스터를 들면 젤이 트레이에서 분리가 되고, 캐스터는 옆면에만 손잡이가 있으니 캐스터에서 젤을 살짝 밀어주면 젤 분리도 가능하거든요. 

 

3. 전기영동을 하려면... -영동 후 결과 확인

 

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저 줄이 뭔지 궁금하시면 그냥 이걸 읽...... 3_3 
 
젤을 만들 떄는 트레이에 캐스터를 장착하고 콤을 꼽고, 나중에 젤이 굳게 되면 콤을 꼽았던 부분에 구멍이 생긴다고 했죠? 그 구멍을 well(웰)이라고 불러요. 이 웰 안에 DNA를 일정량 로딩을 하면 되는데 문제가 있어요. DNA 자체는 무색투명한 액체라 DNA만 내리게 되면 이게 대관절 어디까지 왔는지 안 보이거든요. 그래서 loading dye라는 것을 함꼐 섞은 다음 내려줘야 해요. 보통 이건 6배 농축액이라 염료 1:DNA 5로 섞어 주면 되고, 로딩하는 부피는 정말 생각보다 매우 진심 작은 6ul정도가 됩니다. 아 이게 어느정도인지 실감이 잘 안 오실텐데, 6ul이 천 개 모여야 6ml이 되는 겁니다. (그리고 6ul이 1000000개 모여야 6L) 
 
그리고 한가지가 더 있어요. 그림의 오른쪽을 보면 다른 데는 선이 한두개밖에 없는데 맨 왼쪽을 보면 선이 아주 쫘라라락 있죠? 이건 DNA ladder라고 하는 거예요. 우리가 DNA를 내리고 나서 이게 대충 어느 정도 길이인지를 알기 위해 같이 로딩하는 '자' 같은 거예요. (보통 래더 사면 길이 표도 같이 옴) 이 래더도 내리고자 하는 DNA에 따라 여러 가지로 쓸 수 있어요. 예를 들자면 1kb부터 시작해서 100bp 단위로 끊는 래더라던가, 100bp부터 시작한다던가, 5kb부터 시작한다던가... 참고로 대부분 이런 거 사면 loading dye도 서비스로 딸려와요. 
 
이렇게 전기를 흘리고 나면 결과를 확인해야 하는데 그러려면 필요한 게 또 있어요. 바로 염료입니다...OTL DNA는 뭐 자체적으로 색깔 내는 기능 그딴 거 없고요... Loading dye는 DNA가 얼마만큼 내려갔느냐를 보여주는거지 이게 제대로 똑디 내려간건지 위치까지는 안 보여줘요. (특히 여러개일 경우) 그래서 우리는 DNA가 잘 내려갔는 지 보려면 DNA를 염색해줘야 할 필요가 있죠. 이 분야의 대표 주자는 EtBr, 에티듐 브로마이드와 PI, 프로피듐 이오다이드입니다. 

 

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요 녀석이 프로피듐 뭐시기입니다. 분자가 좀 납작땡땡하죠? (아이오딘은 결합해있는 게 아니라 프로피듐이 +차지라 붙어있는 겁니다) 

 

 

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그리고 요놈도 분자가 납작땡떙하죠. (EtBr) 
 
둘 다 DNA가 이중결합을 하면 염기 사이를 새치기해서 형광을 보여줍니다. 하지만... 이 두 염료에는 치명적인 문제가 하나 있었으니... (두둥) 염기 사이에 끼어 들어가서 염색하는 건 좋은데... 그게 PCR 한 DNA만 염색이 되는 게 아닙니다. 우리 DNA에도 새치기를 해요. 그래서 이 두 녀석들은 발암물질이기도 합니다. 맨손으로 만지면 안돼요. 
 
요즘은 굳이 이 두 녀석을 쓰지 않더라도, loading dye와 DNA 염료의 두 가지 역할을 하는 시약도 나와 있고 사이버 그린이라는 걸 이용하기도 해요. 
 
4. 단백질도 전기영동을 하나요? 
네. 합니다. 
 
DNA와 달리 단백질은 전기영동을 할 때 두 가지 요소가 다 중요합니다. 첫째는 이 단백질을 구성하는 아미노산에 의한 차지이고 두번째가 이 단백질의 크기입니다. 또한 단백질은 더럽게 뚱떙뚱땡하기 떄문에 한천 따위는 뚫지 못 하고 내려가지도 못 하기 떄문에 폴리아크릴아미드로 만든 젤을 이용해야 합니다. (주륵) 근데 뚱뚱한 거 맞음 
 
아미노산에 의한 차지는 뭔가요? 라는 질문에 답변을 하려면 20가지 아미노산에 대해 먼저 알아봐야 합니다. (더럽게 많아보인다면 기분탓입니다) 
아미노산은 공통적으로 탄소로 된 몸통에 머리에는 수소가 있고, 오른손이 카복실기(그래서 ~산), 왼손이 아미노기(그래서 아미노~)입니다. 궁뎅이만 다 달라요. 

 

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(아미노산 중 하나인 메티오닌) 

물론 특수한 녀석인 글라이신을 제외하고는 다 왼손 오른손이 있죠. 글라이신은 궁뎅이도 수소라 규정을 못 합니다. (왼손 분자 오른손 분자에 대해서는 다음에 설명할게요. 그런데 이걸 규정하려면 탄소에 붙어 있는 네 개의 작용기가 다 달라야 합니다) 

 

이 궁뎅이에 달려있는 게 20개가 다 다른데, 이 중에는 탄화수소가 붙어 있는 애들도 있고 끄트머리가 아미노 기(염기성)이거나 카복실기(산성)인 애들도 있습니다. 물론 OH기가 달린 애들도 있고 벤젠네 식구들이 붙은 애들도 있고 황이 붙은 애들도 있고 그래요. 이것들 중 어떤 아미노산이 주로 단백질을 구성하느냐에 따라 당연히 charge가 달라지겠죠? OH이나 카복실기가 붙은 아미노산들이 많으면 -일 거고, 반대로 아미노기가 달린 애들이 많이 붙으면 +차지고요. 그래서 PAGE를 걸 떄 2D로 걸거나 SDS(소듐 도데킬 설페이트-비누예요 비누)를 이용해 차지를 -로 깔맞춤하고 내립니다. 2D의 경우 전기를 두 축으로 내려서 차지와 크기로 분리하는 거고, SDS-PAGE는 SDS로 charge를 깔맞춤 해 줘서 크기로만 분리하는 거예요. 

 

SDS-PAGE의 경우 젤이 두 파트로 나뉘어집니다. 러닝 젤과 스태킹 젤이요. 그럼 이거 어떻게 만드냐고요? 일단 재료를 둘 다 배합한 다음, 러닝 젤에 먼저 TEMED(일종의 경화제)를 넣고 붓습니다. 그 다음, 러닝 젤이 굳으면 스태킹 젤에 TEMED를 넣고 콤을 꼽은 다음 굳히면 됩니다. 여기서 꼭 러닝 젤 안 굳는 사람이 나오죠... 실험 과목 듣다 보면 꼭 한 번은 봅니다. 이거 실화예요. 그럼 두 젤은 뭐 하는 건데 이렇게 나뉘어져 있냐고요? 러닝 젤은 말 그대로 한천 젤에서처럼 단백질을 크기별로 분류하는 겁니다. 그리고 스태킹 젤은 일종의 출발선 역할을 하는거죠. 웰로 로딩한 단백질들이 전기가 흐를 때 스테킹 젤과 러닝 젤이 겹치는 부분, 즉 출발선을 찾아서 먼저 이동하게 되고 그 다음 러닝 젤에서 본격적으로 분리를 하는 거예요. 

 

그리고 단백질에도 size marker(래더)가 있습니다. DNA와 달리 겁나 컬러풀해요. 그리고 PAGE를 만들 떄 사용하는 buffer에 따라서 래더가 다 달라요. 

 


 

다음에는 드디어!!!!!! 4대 블로팅에 대해 소개합니다... 

아니 뭐 거창할 거 없고 이름이 좀 빵터지긴 할거예요. 

 


라이츄 과학츄

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